KASP实验技术说明

对于高GC含量片段（GC%>70%）的扩增，建议首先尝试把标准的touch down 程序(61C-55C) 改成68C-62C，如果效果好的话，就不需再用DMSO优化了。

如果效果不好，再尝试如下：

做两板，分别向总的混合液中加不同体积的DMSO，一个加（Mastermix + Assay Mix) x 5% ul, 一个加（Mastermix + Assay Mix) x 10% ul，看哪一个更好些。

另外，关于低GC含量的片段扩增（GC%<30%），也可以尝试做两板，分别加不同体积的MgCl2，一个加（Mastermix + Assay Mix) x 0.63% ul, 一个加（Mastermix + Assay Mix) x 1.06% ul，看哪一个更好些。

1.多个引物可以一起跑。但KASP技术要求每个引物至少跑22个样品加两个NTC，否则可能影响分群。

2.NTC跑很高可能有两个原因，一是NTC被DNA样品污染，二是循环数太多，引物自身扩增。建议多加几个NTC，注意污染问题，再看看。

3.引物设计时请尽量保证序列准确，多态性位点BLAST结果证明为单拷贝也就是要特异。GC含量尽量不要过高或过低 (最好在30%-70%)。

4.因为您是用的BIORAD平台跑的，所以结果的红X好像是仪器Autocall的，你只需人工将结果再判读一遍，标成它应该有的颜色或符号就行了。

5.一般KASP的重复性是很好的，由于不太清楚你之前具体的试剂及引物订购情况以及您的仪器使用情况，所以您说的两次跑的结果不一样，我可能没法给您准确的分析和答复。

6.对于无信号的样品，可能是DNA浓度低，或加样没加上, 或者该此样品中不含此SNP。

7.引物的长度，如果让我们设计的话，是您发给我们特异性的位点上下游各50bp.

8.PCR体系，不同平台不太一样，您用的5ul体系吗？2.5ul DNA 加 2.5 ul mix, 0.07ul 引物.

9.KASP技术要注意的是，DNA浓度要先做梯度优化，如果分群比较松散，可通过加循环优化。试剂尽量不要反复冻融。

10. 目前验证过KASP的精确度( >99.8%) 要高于芯片，主要芯片是用混样，单个反应里里有多个引物，而KASP技术单个反应里只有一个引物，如果结果不一致，你可以通过第三方的测序平台验证一下他们。

(1)请确保反应混和液充分混匀，一般建议先加引物，后加Mastermix, 充分混匀。

(2)检查引物和扩增片断的GC含量，如GC含量高于70%，建议Touch down改为68C-62C, 或取消touchdown, 改为63C， 36 个循环。

(3)DNA提取过程中是否用到EDTA？ EDTA会阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建议将DNA再稀释一下，做一下浓度梯度实验, 或加MgCl2优化。

(4) 阴性对照不加DNA样本,其余体系正常加.

重要的事情说三遍，终于可以开始实验了,但在实验前或实验中乃在实验后,您可能会遇到以下问题:

1.引物设计提交序列时的注意事项有哪些？

我们要求所提交的序列长度至少为目标位点上下游各50bp。请注意序列来源，尽量保证序列准确，多态性位点BLAST结果证明为单拷贝也就是要特异。标注出不确定的序列及引物设计时需要跳过的碱基和序列，目标位点周围其他多态性位点（最多可以有2个）用IUPAC码标注。

2. PCR反应体系是怎样的？

96孔板，10μL 体系，其中5μL DNA， 5μL mix, 0.14 μL引物。

384孔板，5μL体系，其中2.5μL DNA ， 2.5 μL mix, 0.07μL引物。

384 Array Tape, 1.6μL 体系，其中0.8 μL DNA, 0.8μL mix, 0.022μL 引物。

1536孔板，1ul 体系，其中1.5 μL DNA （烘干），1 μL mix, 0.014μL引物。

3. KASP技术对DNA有什么要求？ 

建议最小的DNA浓度为2.5 ng / μL。根据基因组大小，所需的DNA的量为：待测样品基因组/3000Mb*5ng。建议设置DNA浓度梯度实验，来确定最合适的DNA浓度。 KASP 对DNA纯度的要求不高， 一般粗提的DNA即可满足，但请尽量保证DNA浓度的一致性, 提取及溶解过程中尽量不要用到EDTA， 因为 EDTA会阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建议将DNA稀释一下，做一下浓度梯度实验或加MgCl2优化。

4. 多个引物可以同时跑在同一块板子上吗？ 

可以，但KASP技术要求每个引物至少跑22个样品加两个NTC，否则可能影响分群判读，造成较大的误差。

5. NTC信号值很高，怎么办？ 

NTC跑很高可能有三个原因，一是NTC被DNA样品污染，二是循环数太多，引物 自身扩增。建议多加几个NTC，注意污染问题，再看看。三是，引物设计问题，扩增产物中有引物二聚体存在， 建议重新设计引物。

6. 为什么需要recycling(加循环）, 什么时候需要加循环？

我们以36个循环作为标准的反应程序,由于不同的引物扩增速度及效率不同,部分引物在36个循环时并不能达到反应终点，导致荧光信号较低，分群较分散，影响数据分析。因此，当您发现在跑了36个循环时信号值较低，分群较分散但有分群趋势，即可选择加循环（94度--20秒，57度--60秒，3个循环）。如果NTC没有扩增，最多可加4次循环。

7. KASP 试剂的储存条件及建议是什么？

KASP 引物及Master mix 可在4度保存一周，建议储存在-20度/-80度， Master mix需避光保存， 避免反复冻融（尽量冻融不要超过3次），建议事先将其分装。保存得当，可延长KASP试剂的使用寿命至2-3年。

8. 用qPCR仪做KASP genotyping, 有哪些注意事项？ 

请确定您的qPCR仪型号，订购合适ROX水平的Master mix。请在40度以下读取KASP的终点荧光信号，分析数据时请注意调整XY坐标轴最大最小值相当。所有数据均建议在Autocall 后进行人工判读。如有可能，建议样品板中加阳性对照DNA。

9. 目标片段GC含量太高或太低有什么建议？ 

对于高GC含量片段（GC%>65%）的扩增，建议首先尝试把标准的touch down 程序(61oC-55oC) 改成68oC-62oC。如果效果不好，再尝试加5%-10%Master mix 体积的DMSO。关于低GC含量的片段扩增（GC%<40%），建议首先尝试将touchdown 取消，改为两步法。如果效果不好，再尝试加0.63% 或1.06% Master mix 体积的MgCl2。 

10. 反应完成后的PCR板还可保存多长时间？ 

反应完成后的PCR板可在4度保存一周，荧光信号仍会比较稳定。一周之内加循环或重读数据均可。